苦参碱引起内质网应激的机制及相关药效的研究

【摘要】苦参碱(matrine,MAT)是从中药苦参(SophoraflavescensAit)根中提取的种重要活性成分。在中国MAT已经被广泛地应用于病毒性肝炎、肝纤维化、癌症、心律失常以及皮肤炎症等疾病的治疗。目前虽然已经对MAT的药理作用机制进行了大量的研究,但仍然有不少关键性的问题缺乏深入的探索。因此,本研究对MAT的药理作用机制进行了深入的研究,为指导MAT的临床合理应用和提高治疗效果提供实验依据。首先利用MTT法检测了MAT对不同细胞的增殖抑制作用,发现MAT对人肝癌细胞HepG2较敏感,而对人肝正常细胞L02不敏感。我们选用HepG2和MCF-7两株细胞株进一步探讨了MAT的药理作用机制。MAT通过激活caspase-3和caspase-9,诱导活性氧自由基产生以及破坏线粒体膜电位方式诱导细胞凋亡。在HepG2和MCF-7细胞中,我们进一步证实了尽管MAT诱导自噬早期的特征,但是MAT最终通过抑制溶酶体蛋白酶cathepsinD的成熟而抑制自噬晚期过程。这种作用特点同自噬晚期抑制剂氯喹相似。通过自噬早期抑制剂3-甲基腺嘌呤或者RNA干扰敲低ATG7抑制自噬发生,我们首次证明了MAT诱导的膜泡区别于典型的自噬泡；质子泵阻断剂巴弗洛霉素Al能够抑制MAT诱导的膜泡,说明了MAT诱导的膜泡形成与质子泵有关。我们首次报道了MAT激活内质网应激。通过Westernblot检测内质网应激标志蛋白GRP78和CHOP,我们发现MAT能够上调GRP78和CHOP的表达,因此MAT激活了内质网应激。此外,内质网应激信号通路激酶PERK,IRE1和ATF-6均被MAT激活。内质网应激抑制剂4-苯基丁酸抑制MAT诱导的内质网应激。利用4-苯基丁酸抑制MAT诱导的内质网应激,发现MAT的细胞毒性被显著增强。利用AnnexinV/PI双染技术检测敲低CHOP表达对MAT的凋亡诱导作用的影响,发现MAT的凋亡诱导作用被明显增强,表明了MAT激活内质网应激介导的细胞凋亡作用。根据目前对MAT的研究资料,未见报道细胞中有哪些分子能影响MAT的敏感性。在临床上,MAT主要被用于治疗肝器官方面的疾病,如：病毒性肝炎、肝纤维化等。利用Westernblot技术检测不同细胞中GRP78的表达,我们发现在肝脏相关细胞中GRP78的表达最低,因此MAT的作用药效可能与组织细胞中GRP78的表达有关。通过对比不同细胞IC5o值与细胞中GRP78和p53表达量的关系,发现GRP78和p53表达量较低的细胞对MAT比较敏感,而GRP78和p53表达量较高的细胞对MAT不敏感。通过检测MAT的凋亡诱导作用和增殖抑制作用,我们证明了敲低细胞中GRP78或者p53的表达能明显增强细胞对MAT的敏感性,进一步说明了细胞内GRP78和p53的表达水平影响细胞对MAT的敏感性。初步研究了MAT诱导G1期周期阻滞的机制及其与细胞衰老的关系。MAT处理HepG2和MCF-7细胞引起G1期周期阻滞,这与MAT上调p21、p27表达和上调CyclinD1的表达有关,而与p53的表达无关,MAT诱导p53表达的降低。此外,衰老相关的半乳糖苷酶染色法表明MAT诱导的G1周期阻滞不引起细胞衰老。通过上述研究表明：MAT诱导内质网应激,且细胞内GRP78和p53的表达影响MAT的敏感性；MAT抑制自噬晚期过程的完成,且其诱导的膜泡区别于典型的自噬泡。本研究为MAT相关的衍生物合成和新药研发提供实验基础；也为MAT的临床合理应用、提高疗效提供理论依据。
【作者】欧秀元；
【导师】何琪杨；
【作者基本信息】北京协和医学院，微生物与生化药学，2014，博士
【关键词】苦参碱；内质网应激；自噬；凋亡；敏感性；周期阻滞；

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